菌落計(jì)數(shù)_創(chuàng)新技術(shù)(二)：濾膜與3M測(cè)試片檢測(cè)
（杭州迅數(shù)科技有限公司）
濾膜與3M測(cè)試片，越來(lái)越多的應(yīng)用于生物、醫(yī)藥、食品、環(huán)境等領(lǐng)域的微生物檢測(cè)。很多濾膜或測(cè)試片都有一個(gè)特點(diǎn)，就是在其表面有著不同顏色不同大小的網(wǎng)格線。這些網(wǎng)格有助于人工觀測(cè)計(jì)數(shù)，但卻給目前使用越來(lái)越多的自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀帶來(lái)困難。因?yàn)榫W(wǎng)格的顏色往往很深，導(dǎo)致傳統(tǒng)的方法往往檢測(cè)到網(wǎng)格而不是菌落。下圖1、2、3分別顯示了三種常用的濾膜和3M測(cè)試片，以及采用傳統(tǒng)圖像分割方法的分割結(jié)果。
其中，圖1-a是塞多利斯濾膜原圖，表面有黑色網(wǎng)格，并生長(zhǎng)著淺黃色菌落。圖1-b是采用傳統(tǒng)的閾值分割法的分割效果。圖1-c是采用彩色梯度法的分割效果。由于該濾膜的網(wǎng)格顏色比菌落還深，傳統(tǒng)圖像處理方法分割出來(lái)的是網(wǎng)格而不是菌落。
圖1. 塞多利斯濾膜
圖2-a是3M金黃色葡萄球菌測(cè)試片，表面有黃色網(wǎng)格和紫色菌落。圖1-b是采用傳統(tǒng)的閾值分割法的分割效果。圖1-c是采用彩色梯度法的分割效果。這兩種分割方法在分割出菌落的同時(shí)，將網(wǎng)格也分割出來(lái)，從而無(wú)法對(duì)菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。
圖2. 3M金黃色葡萄球菌測(cè)試片
圖3-a是3M大腸桿菌測(cè)試片，表面有紅色網(wǎng)格、紅色菌落、和紅色背景。這種情況是最復(fù)雜的，無(wú)論采用傳統(tǒng)的閾值分割法（圖3-b）、還是彩色梯度分割法（圖3-c），都不可能得到理想的效果。
圖3. 3M大腸桿菌測(cè)試片
事實(shí)證明，傳統(tǒng)的圖像處理技術(shù)，已經(jīng)無(wú)法解決上述濾膜或3M測(cè)試片的菌落檢測(cè)，必須研究建立新的檢測(cè)方法。迅數(shù)_科技團(tuán)隊(duì)，歷時(shí)兩年的攻關(guān)，基于目前國(guó)際上先進(jìn)的水平集活動(dòng)輪廓模型，結(jié)合濾膜與3M測(cè)試片的特點(diǎn)，形成適合濾膜或3M測(cè)試片的全新分割算法，成功解決了上述問(wèn)題。
1、基于形態(tài)約束的水平集活動(dòng)輪廓模型
基于水平集活動(dòng)輪廓模型的圖像分割原理，是在極小化能量泛函的過(guò)程中，使活動(dòng)輪廓不斷逼近分割目標(biāo)。如果在能量泛函中引入基于先驗(yàn)知識(shí)的約束條件，促使活動(dòng)輪廓向約束條件所規(guī)定的目標(biāo)逼近，就能分割出希望尋找的目標(biāo)來(lái)。國(guó)際上較早提出的主要有以下兩種思路。
一種是Cremers提出的基于先驗(yàn)知識(shí)約束的模型。設(shè)先驗(yàn)知識(shí)所確定的形狀用水平集Ф0表示，基于形狀先驗(yàn)知識(shí)的活動(dòng)輪廓模型在能量泛函中加入一項(xiàng)形狀約束能量項(xiàng)，用來(lái)引導(dǎo)曲線收斂于這個(gè)形狀：
式中， 定義了形狀先驗(yàn)知識(shí)發(fā)生作用的范圍， 的區(qū)域被排除在積分之外。這種方法嚴(yán)格規(guī)定了形狀信息的位置和大小，在實(shí)際應(yīng)用中受到局限。
另一種是Tony Chan提出的基于形狀先驗(yàn)知識(shí)的活動(dòng)輪廓模型，該模型允許形狀的平移、縮放和旋轉(zhuǎn)等。如果水平集Ф2是由水平集Ф1經(jīng)過(guò)平移、旋轉(zhuǎn)、縮放得到的，設(shè)平移坐標(biāo)為a,b，縮放倍數(shù)為r，旋轉(zhuǎn)角度為θ，那么兩個(gè)水平集的關(guān)系表達(dá)式為：
若ψ0是某一固定形狀的水平集函數(shù)，該水平集函數(shù)通過(guò)求解符號(hào)距離函數(shù)得到。ψ是原形狀通過(guò)平移、旋轉(zhuǎn)或縮放后對(duì)應(yīng)的水平集函數(shù)。那么基于形狀先驗(yàn)知識(shí)的水平集模型能量函數(shù)為：
以上兩種方法的數(shù)值求解，涉及對(duì)能量函數(shù)多個(gè)變量的梯度下降流求解，每次曲線迭代都需要對(duì)多個(gè)變量更新，所以活動(dòng)輪廓模型的逼近速度非常慢，無(wú)法實(shí)際采用。
對(duì)網(wǎng)格濾膜或3M測(cè)試片而言，需要檢測(cè)的菌落通常呈圓形，則水平集的形狀先驗(yàn)知識(shí)可以設(shè)為圓形。對(duì)圓形來(lái)說(shuō)，其幾何變換中的平移和縮放只會(huì)導(dǎo)致形狀變化，旋轉(zhuǎn)是不會(huì)對(duì)圓形形狀產(chǎn)生影響的，所以基于圓形的水平集模型只需要三個(gè)額外變量（a,b,r），則基于圓形約束的水平集活動(dòng)輪廓模型的能量泛函可以簡(jiǎn)化為：
式中，第二項(xiàng)即為約束項(xiàng)，其作用即促使最終輪廓線收斂為一個(gè)圓形。該模型中除了需要對(duì)水平集函數(shù)求梯度下降流之外，只需要對(duì)（a,b,r）三個(gè)變量更新，迭代次數(shù)大大減輕，提高分割速度。
為實(shí)現(xiàn)對(duì)平皿上多個(gè)菌落的同步檢測(cè)，需要進(jìn)一步引入多相水平集活動(dòng)輪廓模型；同時(shí)為了進(jìn)一步提高檢測(cè)速度，需要采用水平集活動(dòng)輪廓模型的快速求解方法。而這兩方面，迅數(shù)科技科的研究團(tuán)隊(duì)均已取得重要成果和實(shí)際應(yīng)用，可以參閱“迅數(shù)科技有限公司”發(fā)表的《菌落計(jì)數(shù)_創(chuàng)新技術(shù)(一)：水平集活動(dòng)輪廓模型》）。
2、對(duì)表面皺褶、邊緣模糊菌落的檢測(cè)效果
基于形態(tài)約束的水平集活動(dòng)輪廓模型，既保留了水平集活動(dòng)輪廓模型所具有的抗噪性強(qiáng)、分割邊界光滑連續(xù)、可以處理表面結(jié)構(gòu)復(fù)雜的情況等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)又能非常好的逼近圓形目標(biāo)。尤其對(duì)一些輪廓模糊、表面皺褶比較嚴(yán)重的菌落或細(xì)胞，展現(xiàn)出極其優(yōu)越的分割效果。
圖4顯示了對(duì)一個(gè)邊緣模糊的原生質(zhì)體細(xì)胞的檢測(cè)效果。其中，圖4-a是原生質(zhì)體細(xì)胞原圖；圖4-b采用的是一般的水平集活動(dòng)輪廓模型，由于缺乏圓形約束，檢測(cè)到的是一個(gè)非圓；圖4-c采用的是迅數(shù)科技開發(fā)的“基于形態(tài)約束的水平集活動(dòng)輪廓模型”算法，由于受到圓形約束，最后逼近的必然是個(gè)圓，從而很好的還原了細(xì)胞原態(tài)。
圖4. 邊緣模糊原生質(zhì)體細(xì)胞的檢測(cè)效果
圖5顯示了對(duì)一個(gè)表面皺褶十分嚴(yán)重的原生質(zhì)體細(xì)胞的檢測(cè)效果。其中，圖4-a是原生質(zhì)體細(xì)胞原圖；圖4-b采用的是一般的水平集活動(dòng)輪廓模型，由于缺乏圓形約束，檢測(cè)到的是一堆碎片；圖4-c采用的是迅數(shù)科技開發(fā)的“基于形態(tài)約束的水平集活動(dòng)輪廓模型”算法，由于受到圓形約束，最后逼近的是一個(gè)完整的原生質(zhì)體細(xì)胞。
圖5. 表面皺褶原生質(zhì)體細(xì)胞的檢測(cè)效果
3、對(duì)濾膜和3M測(cè)試片的檢測(cè)效果
圖6展示了采用迅數(shù)科技開發(fā)的“基于形態(tài)約束的水平集活動(dòng)輪廓模型”，對(duì)網(wǎng)格濾膜和3M測(cè)試片的檢測(cè)效果。其中，圖6-a、6-b、6-c分別是塞多利斯濾膜、3M金黃色葡萄球菌測(cè)試片、3M大腸桿菌測(cè)試片的原圖。圖6-d、6-e、6-f是采用“基于形態(tài)約束的水平集活動(dòng)輪廓模型”后的分割效果。由于具有圓形約束，活動(dòng)輪廓避免了對(duì)網(wǎng)格的逼近，而最終檢測(cè)出全部圓形菌落。
圖6. 基于形態(tài)約束的水平集活動(dòng)輪廓模型效果
4、展望
基于水平集活動(dòng)輪廓模型的圖像分割方法，具有抗噪性強(qiáng)、數(shù)值求解穩(wěn)定性好、分割邊界光滑連續(xù)、可以處理拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)復(fù)雜的情況等優(yōu)點(diǎn)，成為目前國(guó)際上前沿的圖像分割技術(shù)之一。
迅數(shù)科技研發(fā)團(tuán)隊(duì)，歷經(jīng)兩年多的攻關(guān)，不僅掌握了這一先進(jìn)技術(shù)，而且針對(duì)微生物菌落的特點(diǎn)，在傳統(tǒng)的水平集活動(dòng)輪廓模型的基礎(chǔ)上，創(chuàng)造性的研究開發(fā)出適合復(fù)雜菌落分割計(jì)數(shù)的快速活動(dòng)輪廓模型、多相水平集活動(dòng)輪廓模型、以及基于形態(tài)約束的水平集活動(dòng)輪廓模型。這些模型不僅實(shí)現(xiàn)了復(fù)雜菌落、高難度平皿的準(zhǔn)確有效統(tǒng)計(jì)，而且也適用于細(xì)胞等的檢測(cè)。 |
