菌落計數_創新技術(四)：多菌種混雜情況的檢測
（杭州迅數科技有限公司）
在菌落計數中，常常會碰到這樣一種情況，即培養皿中生長著多種不同種類的菌落：有真菌、細菌、霉菌、放線菌等等。不同種類的菌落，往往顏色不同、生長形態不同。尤其是霉菌和放線菌，其表面往往呈碎顆粒狀，碎顆粒的密度不一樣，中間密度高從而顏色深、邊上密度低從而顏色淺；另外其邊緣往往呈毛刺狀或云霧狀，面積則比一般菌落大許多。圖1顯示了三個包含霉菌和其它菌混雜的培養皿。
圖1 多菌種混雜生長的培養皿
這種多菌種混雜、尤其是存在霉菌和放線菌的情況，給自動化菌落計數帶來困難。這是由于目前的自動化菌落計數是建立在圖像分割技術基礎上，而圖像分割主要依據目標物與背景之間的差異性來進行的，比如兩者的灰度差異、顏色差異、或邊緣輪廓的突變性等等。
圖2顯示了采用傳統圖像分割技術，對包含霉菌的多菌種混雜的培養皿的分割效果。其中，圖2-a是培養皿原圖、圖2-b是采用傳統圖像分割技術的分割結果、圖2-c是對分割后的顆粒進行顏色填充以方便觀察。不難看到：（1）由于霉菌表面呈碎顆粒狀，導致圖像分割將其分成一顆顆碎小顆粒。（2）霉菌表面的顏色變化，其邊緣呈乳白色云霧狀，轉換成灰度后與其它白色菌落接近；而中間成墨綠色，轉換成灰度后與背景的灰度相接近。這就導致傳統的灰度分割技術必然把邊緣部分當作菌落一類、而把中心部分當作背景一類來處理。（3）霉菌邊緣的云霧狀或模糊性，導致沒有明顯的邊緣梯度變化，從而無法采用邊緣梯度分割技術。
圖2 傳統圖像分割技術對多菌種混雜情況的處理結果
基于水平集活動輪廓模型的圖像分割技術，是目前國際上較為前沿的圖像處理技術。該技術將水平集和活動輪廓模型結合起來，在極小化能量泛函的過程中，使活動輪廓不斷逼近目標而實現對目標的分割。這一特點尤其適合對霉菌的檢測，事實上，杭州迅數科技公司歷經多年研究，已成功應用水平集活動輪廓模型解決霉菌放線菌等的檢測，并取得理想效果（詳見本公司網站文獻《菌落計數_創新技術（1~3）》）。
但當霉菌放線菌與其它菌種混合在一起時，問題就變得更加復雜。這時，采用水平集活動輪廓模型往往對一種菌落有效、而對另一種菌落效果不好。在調整模型參數或約束條件后，對另一種菌落有效了、而對這種菌落的效果又不好了。事實上，上述培養皿所表現出來的，是一個多菌種、多目標、多特征的復雜問題。采用單一的水平集活動輪廓模型，已經無法取得理想效果。針對多目標、多特征的分割問題，目前國際上研究較多的主要有以下兩種方法：（1）多相CV模型、（2）多層水平集框架模型。
1、多相CV模型
由Chan和Vese提出的一種多相水平集分割算法，即多相CV模型[1]。該算法在確定目標種類數之后，采用m個水平集函數相互約束地分割，并且可以用m個水平集函數表示2m個不重疊區域，從而避免在區域內部存在真空或者區域之間存在重疊現象。
多相CV模型的能量泛函為：
其中u0是原圖像數據，cI是第I個區域的平均灰度值，xI是第I個區域的水平集表示，Фi為第i個水平集函數。以分割四相圖像為例，引入兩個水平集函數Ф1和Ф2，與此對應須設置兩個初始輪廓，設圖像u0被分為四個相互不重疊區域：
則能量泛函演變為：
其中Ф=(φ1,φ2)，c=(c11,c10,c01,c00)中的分量分別代表圖像u0在Ω11，Ω12，Ω21和Ω22區域內的平均灰度，如圖3所示。
圖3 兩相水平集示意圖
該模型中的兩個輪廓短線同時演化，對應水平集函數也分別進行迭代運算，通過求解上式能量泛函對應的Euler-Lagrange方程可以得到梯度下降流公式如下：
其中灰度均值 C11，C10，C01和C00可分別在每次迭代中采用如下方式進行更新：
2、多層水平集框架[2]
與多相CV模型采用多個水平集函數不同，多層水平集框架是建立在一種圖層的概念上的，并且只用一個基于CV模型的水平集函數，以一種層級演化的方式來進行多目標分割，屬于串行多相分割算法。
定義原始圖層為
其中， 代表第l類目標的第i個區域。lm表示第l類目標的區域數目，并集 表示第l類目標的集合， 為背景區。
首先利用單水平集分割出原始圖層L0，提取第一類目標區域，然后用除第一類目標區以外的區域灰度平均值掩蓋該第一類目標區，產生一個新的背景區域類 ，圖層狀態變為：
原始圖層L0到新圖層L1的轉換過程如圖4所示。原始圖層L0包含兩類目標 和 ，當第一類目標區域被分割出并用第二類目標區域與背景區域的灰度平均值替換時，形成圖層L1，這樣L1中只剩下第二類目標區域，剩下區域視為背景。當待分割圖像有多類目標區域時，可以利用這一思想逐個分出某一類目標區域，直到沒有目標為止，數學歸納如下：
圖4 原始圖像層L0向新圖像層L1的轉換
最終得到不含任何目標的圖層Ln，即背景層Lbackground：
多層水平集框架仍依賴于CV模型，與傳統CV模型不同的是，水平集函數一次只作用于一個圖層，并對產生的新圖層進行迭代演化，所以引入水平集函數，第l層(l=0,1,2,…,n-1)上的能量函數為：
與CV模型中參數相同，Cl表示Ll層上的演化曲線。引入時間變量t≥0，可得Ll上的水平集演化方程：
3、試驗
以上介紹的多相CV模型，是一種并行模型。其可在不加約束條件的情況下，避免水平集函數作用區域的重疊覆蓋以及漏覆蓋問題。但多個水平集最終可能收斂到一個區域，另外該模型假定了圖像中區域的個數。而實際菌落圖像往往很復雜，難以人為劃定區域，因此這種方法實際使用時會比較麻煩。多層水平集框架，屬于水平集串行分割方法。其每次分割得到的輪廓曲線位于前一次分割得到的輪廓曲線內部，可以保證各水平集收斂目標不同，且具有從屬關系，使用相對簡單。本試驗主要采用多層水平集框架模型。
圖5顯示了對多菌種、多特征菌落采用多層水平集框架模型的檢測效果。其中圖5-a是原圖、圖5-b是采用多層水平集框架模型的分割結果、圖5-c對分割輪廓內部進行顏色填充以便觀察。為解決部分菌落相互粘連的問題，試驗中增加了分水嶺粘連分割。
由圖5不難看到，由于水平集活動輪廓模型分割技術是在極小化能量泛函的過程中，使活動輪廓不斷逼近目標而實現對目標的分割，所以不存在對霉菌表面微小顆粒的過分割現象。此外，能量函數建立在輪廓內外的灰度方差基礎上，因此活動輪廓在收縮時，不會受各種菌落顏色不同的影響而導致誤分割。除極個別地方尚不完善外，絕大多數菌落都得到了準確的分割。
圖5 基于多層水平集框架模型的分割效果
4、展望
基于水平集活動輪廓模型的圖像分割方法，具有抗噪性強、數值求解穩定性好、分割邊界光滑連續、可以處理拓撲結構復雜的情況等優點，成為目前國際上前沿的圖像分割技術之一。多相CV模型和多層水平集框架模型都是基于水平集為基礎，在解決多目標、多特征的分割問題上具有較好效果。為多菌種混雜情況的菌落檢測提供了一種可行的方法。
但多相CV模型和多層水平集框架模型的每次迭代計算都需要初始化，導致計算量較大，分割耗時。隨著問題復雜性的增加，其計算復雜性也顯著升高。除此之外，這兩種方法初始輪廓的選取還存在偶然性，預選區域的大小及形狀均會影響分割的結果，須要進一步研究。
5、參考文獻
[1] Zheng Gang, Li Yuanlu, Wang Huinan. A new multi-phase level set framework for 3D medical image segmentation based on TPBG [C]. 27th Annual International Conference of IEEE EMBC05, Shanghai, 2005.
[2] 王曉峰.水平集方法及其在圖像分割中的應用研究[J].中國科學技術大學，2011(02).
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